β-珠蛋白疾病（如镰状细胞病（SCD）和β-地中海贫血）是全球发病率较高的单基因遗传性疾病，其主要病理在于β-珠蛋白的合成缺陷或结构异常。目前，已有的药物（如busulfan）疗效有限并需终生服用，而异基因造血干细胞（HSC）移植虽有治愈潜力，却受限于供体配对的挑战。虽然胎儿期的γ-珠蛋白（HbF）可以部分或完全替代β-珠蛋白的功能并缓解临床症状，但HbF在出生后很快下降。因此，如何稳定激活HbF的表达已成为当前基因治疗的一个重要研究方向。

BCL11A被认为是调控γ-珠蛋白表达的关键转录因子，其在红细胞中的特异性表达受BCL11A内含子2中多个增强子（+58、+55和+62）的控制。其中，+58位点被证实为最有效的靶点，目前的临床试验也集中在该位点的基因编辑上。然而，由于个体间的应答差异，单一位点的编辑可能难以实现理想的长期疗效。因此，本研究设想同时靶向+58与+55增强子，评估其是否能够实现更高效和持久的HbF诱导效果，并探索以CD45抗体-药物偶联物（ADC）替代传统化疗作为移植前的预处理手段。

研究首先聚焦于BCL11A的+58和+55增强子，两个关键的HbF表达调控区域。以往的研究指出，+58是最有效的单点，但HbF的应答依然存在个体差异。为进一步增强疗效，研究团队构建了多组CRISPR-Cas9编辑方案，针对+58、+55及双靶点的联合编辑。在猴源CD34⁺造血干/祖细胞的体外编辑实验中，发现联合编辑组的HbF表达水平显著高于任一单点经典方案，同时未对细胞活力或红系分化能力产生影响，验证了双靶点协同编辑的优势。

为了验证已编辑细胞在体内的表现，研究团队将经过联合编辑的自体CD34⁺细胞注入预先接受busulfan处理的恒河猴体内，并进行了为期四年的长期追踪。结果表明，编辑细胞在多种血液细胞谱系中稳定存在，包括粒细胞、T细胞、B细胞和骨髓造血干细胞等，无任何异常分化或毒性迹象。HbF水平在术后第二个月达到高峰，并能维持稳定，表明其具备长期且可控的γ-珠蛋白表达能力。

研究继续模拟临床可用的增强策略，在HbF稳定表达后，通过放血和羟基脲（HU）进行干预。结果显示，编辑过的动物在接受放血或HU治疗后，HbF水平再次显著升高，而未编辑的对照动物则未观察到同样的反应。这表明BCL11A增强子编辑后，红细胞对γ-珠蛋白诱导机制变得更加敏感，为后续的治疗调控提供了灵活的空间。此外，即使不进行放血，单用羟基脲也能显著提升HbF，证明其在非应激状态下亦具增强效果。

研究者还深入分析了编辑类型和质量，明确评估哪些突变是有效的。通过对移植前后细胞进行ddPCR和深度测序，发现大多数编辑属于程序化的31kb缺失或倒位，精准破坏了+55和+58增强子的核心GATA1结合位点，证实了有效靶向的理想结果。而非计划性的长片段缺失或复杂重排在移植前细胞中比例较高，但在体内几乎未见，说明此类“异常编辑”不具长久的造血能力，并进一步增强了策略的可预见性。

为确保编辑的安全性，研究团队使用CIRCLE-seq和深度测序系统检测+55与+58靶向sgRNA在灵长类基因组内的潜在脱靶位点。在所有动物体内外的采样中，仅发现一个位点（OT9）在极低频率（<0.24%）接近检测下限，且没有扩增趋势，确保了良好的生物安全性。

传统的busulfan虽然有效，但毒性较大，限制了基因治疗的推广。因此，研究尝试使用CD45抗体-药物偶联物（CD45-ADC）作为靶向清髓方式，进行干细胞移植前的预处理。在猴模型中，单次CD45-ADC预处理便可有效清除骨髓空间，使后续编辑细胞得以成功植入，并达到了与busulfan组相当甚至更高的HbF表达水平和克隆多样性。这一策略显著减少了毒副作用，展示了“无化疗”基因治疗的新方向。

通过全面的体外编辑、长期植入、药物增强及预处理替代，本研究验证了双增强子靶向与非化疗预处理在灵长类动物中实现长期、安全、高效HbF重激活的可行性，为β-地中海贫血和镰状细胞病的根治提供了坚实的技术基础。

本研究中提到的靶点包括BCL11A，作为HbF表达的关键抑制因子，它通过调控γ-珠蛋白的表达在造血系统中发挥重要作用。CD45则作为一个理想的靶向分子，能够有效清除骨髓造血系统细胞，避免常规化疗的非特异性毒性。选择Z6·尊龙凯时的高品质生命科学试剂将助力您在β-珠蛋白相关疾病研究中的探索，实现研究的突破。

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